高通量測序

　　名詞解釋

　　根據(jù)發(fā)展歷史、影響力、測序原理和技術(shù)不同等，主要有以下幾種：大規(guī)模平行簽名測序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克?。≒olony Sequencing）、454焦磷酸測序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、離子半導(dǎo)體測序（Ion semiconductor sequencing）、DNA 納米球測序 （DNA nanoball sequencing）等。

　　高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，因此在有些文獻(xiàn)中稱其為下一代測序技術(shù)(next generation sequencing)足見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deep sequencing)。

　　實驗過程

　　1.樣本準(zhǔn)備（sample fragmentation）

　　2.文庫構(gòu)建(library preparation)

　　3.測序反應(yīng)(sequencing reaction)

　　4.數(shù)據(jù)分析(data analysis)

　　測序平臺

　　自從2005年454 Life Sciences公司（2007年該公司被Roche正式收購）推出了454 FLX焦磷酸測序平臺（454 FLX pyrosequencing platform）以來，因為他們的拳頭產(chǎn)品毛細(xì)管陣列電泳測序儀系列（series capillary array electrophoresis sequencing machines）遇到了兩個強(qiáng)有力的競爭對手，曾推出過3730xl DNA測序儀（3730xl DNA Analyzer）的Applied BioSystem（ABI）這家一直占據(jù)著測序市場最大份額的公司的領(lǐng)先地位就開始動搖了，一個就是羅氏公司(Roche)的454 測序儀(Roch GS FLX sequencer)，，另一個就是2006年美國Illumina公司推出的Solexa基因組分析平臺（Genome Analyzer platform），為此，2007年ABI公司推出了自主研發(fā)的SOLiD 測序儀(ABI SOLiD sequencer)。這三個測序平臺即為目前高通量測序平臺的代表。

　　Roche 454焦磷酸測序

　?。╬yrophosphate sequencing）

　　Illumina Solexa 合成測序

　　（sequence by synthesis）

　　Illumina Genome AnalyzerIIx測序原理

　　Illumina公司的新一代測序儀Hiseq 2000和Hiseq 2500具有高準(zhǔn)確性，高通量，高靈敏度，和低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢，可以同時完成傳統(tǒng)基因組學(xué)研究（測序和注釋）以及功能基因組學(xué) （基因表達(dá)及調(diào)控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。Hiseq是一種基于單分子簇的邊合成邊測序技術(shù)，基于專有的可逆終止化學(xué)反應(yīng)原理。測序時將基因組DNA的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的玻璃表面（即Flow cell），這些DNA片段經(jīng)過延伸和橋式擴(kuò)增后，在Flow cell上形成了數(shù)以億計Cluster，每個Cluster是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的SBS（邊合成邊測序）技術(shù)對待測的模板DNA進(jìn)行測序。

　　ABI SOLiD連接法測序

　　（sequence by ligation）

　　技術(shù)應(yīng)用

　　測序技術(shù)推進(jìn)科學(xué)研究的發(fā)展。隨著第二代測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，科學(xué)界也開始越來越多地應(yīng)用第二代測序技術(shù)來解決生物學(xué)問題。比如在基因組水平上對還沒有參考序列的物種進(jìn)行從頭測序（de novo sequencing），獲得該物種的參考序列，為后續(xù)研究和分子育種奠定基礎(chǔ)；對有參考序列的物種，進(jìn)行全基因組重測序（resequencing），在全基因組水平上掃描并檢測突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)個體差異的分子基礎(chǔ)。在轉(zhuǎn)錄組水平上進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測序（whole transcriptome resequencing），從而開展可變剪接、編碼序列單核苷酸多態(tài)性（cSNP）等研究；或者進(jìn)行小分子RNA測序（small RNA sequencing），通過分離特定大小的RNA分子進(jìn)行測序，從而發(fā)現(xiàn)新的microRNA分子。在轉(zhuǎn)錄組水平上，與染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技術(shù)相結(jié)合，從而檢測出與特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA區(qū)域和基因組上的甲基化位點(diǎn)。

　　這邊需要特別指出的是第二代測序結(jié)合微陣列技術(shù)而衍生出來的應(yīng)用--目標(biāo)序列捕獲測序技術(shù)（Targeted Resequencing）。這項技術(shù)首先利用微陣列技術(shù)合成大量寡核苷酸探針，這些寡核苷酸探針能夠與基因組上的特定區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，從而富集到特定區(qū)段，然后用第二代測序技術(shù)對這些區(qū)段進(jìn)行測序。目前提供序列捕獲的廠家有Agilent和Nimblegen ，應(yīng)用最多的是人全外顯子組捕獲測序?？茖W(xué)家們目前認(rèn)為外顯子組測序比全基因組重測序更有優(yōu)勢，不僅僅是費(fèi)用較低，更是因為外顯子組測序的數(shù)據(jù)分析計算量較小，與生物學(xué)表型結(jié)合更為直接。

　　目前，高通量測序開始廣泛應(yīng)用于尋找疾病的候選基因上。內(nèi)梅亨大學(xué)的研究人員使用這種方法鑒定出Schinzel-Giedion 綜合征中的致病突變，Schinzel-Giedion綜合征是一種導(dǎo)致嚴(yán)重的智力缺陷、腫瘤高發(fā)以及多種先天性畸形的罕見病。他們使用Agilent SureSelect序列捕獲和SOLiD對四位患者的外顯子組進(jìn)行測序，平均覆蓋度為43倍，讀長為50 nt，每個個體產(chǎn)生了2.7-3 GB可作圖的序列數(shù)據(jù)。他們聚焦于全部四位患者都攜帶變異體的12個基因，最終將候選基因縮小至1個。而貝勒醫(yī)學(xué)院基因組測序中心也計劃對15種以Science雜志年度十大科學(xué)突破上疾病進(jìn)行研究，包括腦癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、膀胱癌、心臟病、糖尿病、自閉癥以及其他遺傳疾病，以更好地理解致病突變以及突變對疾病的影響。前不久剛剛結(jié)束的評選中，外顯子組測序名列其中。

　　以上我們盤點(diǎn)了2010年第二代測序技術(shù)的最新進(jìn)展和相關(guān)應(yīng)用。但是除了第二代測序之外，還有另外一種以單分子實時測序和納米孔為標(biāo)志的第三代測序技術(shù)也正在如火如荼的發(fā)展中，只是還沒有正式發(fā)布。所以目前科學(xué)界所說的高通量測序還指的是第二代測序。

　　意義

　　高通量測序技術(shù)的誕生可以說是基因組學(xué)研究領(lǐng)域一個具有里程碑意義的事件。該技術(shù)使得核酸測序的單堿基成本與第一代測序技術(shù)相比急劇下降, 以人類基因組測序為例, 上世紀(jì)末進(jìn)行的人類基因組計劃花費(fèi) 30 億美元解碼了人類生命密碼, 而第二代測序使得人類基因組測序已進(jìn)入萬(美)元基因組時代。如此低廉的單堿基測序成本使得我們可以實施更多物種的基因組計劃從而解密更多生物物種的基因組遺傳密碼。同時在已完成基因組序列測定的物種中, 對該物種的其他品種進(jìn)行大規(guī)模地全基因組重測序也成為了可能。